BCA (Bicinchoninic acid) 法是目前應(yīng)用比較廣泛的蛋白質(zhì)濃度測定方法?；陔p縮脲反應(yīng)，即在堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)將Cu2+還原成Cu+，Cu+與BCA試劑形成紫顏色的絡(luò)合物，在562 nm處有高的吸光值，該反應(yīng)產(chǎn)物的量與蛋白質(zhì)濃度成正比。測定其在562 nm處的吸光值，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，即可計(jì)算待測蛋白的濃度。該方法快速靈敏、穩(wěn)定可靠且對(duì)不同種類蛋白質(zhì)變異系數(shù)很小。試劑盒中提供了濃度穩(wěn)定的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

BCA蛋白定量試劑盒產(chǎn)品作用
準(zhǔn)確靈敏，線性范圍廣：BCA 試劑的蛋白質(zhì)測定范圍是 10-2000μg/mL。

快速：45 分鐘內(nèi)完成測定，比經(jīng)典的 Lowry 法快 4 倍而且更加方便。  

經(jīng)濟(jì)實(shí)用：在微孔板中進(jìn)行測定，可大大節(jié)約樣品和試劑用量。  

效果穩(wěn)定：不受樣品中離子型和非離子型去污劑影響，檢測不同蛋白質(zhì)分子的變異系數(shù)遠(yuǎn)小于考馬斯亮藍(lán)。

BCA蛋白定量試劑盒使用說明

一、配制標(biāo)準(zhǔn)品和工作液

1. 配制 BSA 標(biāo)準(zhǔn)品體系（線性范圍 20-2000 μg/mL 或者 5-250μg /mL 標(biāo)準(zhǔn)品制備各 2 種配置方法，請(qǐng)根

據(jù)習(xí)慣選用恰當(dāng)方式）。

2. 配制 BCA 工作液

(1) 計(jì)算所需要的總 BCA 工作液體積。總 BCA 工作液體積=（標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量+待測樣品數(shù)量）x 重復(fù)數(shù) x 每個(gè)

樣品所需要的 BCA 工作液。

(2) 配制 BCA 工作液：50 體積的 BCA 試劑 A 中加入 1 體積的 BCA 試劑 B（A:B=50:1），充分混勻。

二、檢測方法

1. 試管檢測方法（樣品:BCA 工作液=1:20）

(1) 各取 100 μL 標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品加入到反應(yīng)管中。

(2) 每管加入 2.0 mL BCA 工作液，混勻。根據(jù)待測樣品的濃度范圍選擇孵育時(shí)間和溫度。

標(biāo)準(zhǔn)孵育方法：37℃ 孵育 30 min 或者室溫 2h（檢測范圍：20-2000 μg/mL）

增強(qiáng)孵育方法：60℃ 孵育 30 min（檢測范圍：5-250 μg/mL）

(3) 冷卻到室溫。在分光光度計(jì)上進(jìn)行檢測，設(shè)定波長為 562 nm，在 10 min 內(nèi)對(duì)所有樣品讀數(shù)。

(4) 根據(jù) BSA 標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度（減去標(biāo)準(zhǔn)品中空白孔的 OD 值即最終的讀數(shù)），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（X-蛋白濃

度μg/mL；Y-最終的 OD 562nm）。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品的稀釋倍數(shù)計(jì)算樣品蛋白濃度。

2. 微孔板檢測方法（樣品: BCA 工作液=1:20）

(1) 各取 10 μL 標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品加入到微孔板中。

(2) 每孔加入 200 μL BCA 工作液，槍頭吹打充分混勻。蓋上微孔板，37℃ 孵育 30 min。

(3) 冷卻到室溫，在酶標(biāo)儀上的 562 nm 波長范圍處檢測吸光度。

(4) 根據(jù) BSA 標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度（減去標(biāo)準(zhǔn)品中空白孔的 OD 值即最終的讀數(shù)），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（ X-蛋白濃

度μg/mL；Y-最終的 OD 562nm）。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品的稀釋倍數(shù)計(jì)算樣品蛋白濃度。

BCA蛋白定量試劑盒注意事項(xiàng)

1、為保證蛋白濃度測量的準(zhǔn)確性，最好做3個(gè)復(fù)孔，必要時(shí)剔除離群值。

2、BCA法測蛋白濃度易受時(shí)間及溫度的影響，所以最好每次測定都做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3、加樣時(shí)一定要準(zhǔn)確加樣且盡可能避免氣泡產(chǎn)生，以免影響測量（加樣結(jié)束可以用注射器戳破氣泡，并將96孔板放在搖床上混勻片刻，以使樣品與工作液充分接觸）。

4、孵育結(jié)束應(yīng)盡快檢測吸光度，并盡可能加快檢測速度，以免帶來誤差。

5、確保所有試劑在使用前充分混合且在推薦的溫度下存儲(chǔ)。試劑的新鮮度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著影響，過期或不當(dāng)存儲(chǔ)的試劑可能導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果。

6、在進(jìn)行BCA實(shí)驗(yàn)時(shí)，嚴(yán)格按照試劑添加順序和操作步驟進(jìn)行，避免任何步驟的顛倒或省略。