Quick Cell 發(fā)光法支原體檢測(cè)試劑盒

產(chǎn)品描述
　　Quick Cell發(fā)光法支原體檢測(cè)試劑盒，通過(guò)檢測(cè)支原體的特異性酶活性以達(dá)到檢測(cè)體外培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞是否被支原體污染的目的。
　　在支原體裂解后，該支原體特異性的酶，在底物存在下，具有將ADP轉(zhuǎn)化成ATP的功能。由于熒光素酶（Luciferase）催化底物熒光素（Luciferin）產(chǎn)生光的反應(yīng)需要ATP的參與，支原體特異性酶催化產(chǎn)生的ATP含量，可以通過(guò)該反應(yīng)轉(zhuǎn)化成生物發(fā)光（Bioluminescence）信號(hào)，該信號(hào)可以使用專門的發(fā)光檢測(cè)儀（Luminometer）或具有發(fā)光檢測(cè)功能的多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)光的強(qiáng)度與ATP的含量成正比。通過(guò)比較細(xì)胞培養(yǎng)上清和未用于細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液上清二者的支原體特異性酶的含量，即可知道培養(yǎng)的細(xì)胞是否被支原體污染。反應(yīng)原理如下：

訂購(gòu)信息

運(yùn)輸與保存
干冰運(yùn)輸。-20℃短期保存，-80℃長(zhǎng)期保存；有效期60個(gè)月。
使用方法
1.檢測(cè)試劑的準(zhǔn)備
　　產(chǎn)品從-80 ℃冰箱取出，在冰上操作，*使用，分別用2.5 mL支原體檢測(cè)溶液溶解試劑A和試劑B（注：因?yàn)樵噭?A 和試劑 B 的離心管容量不足2.5 mL，可以分別先用1 mL 支原體檢測(cè)溶液將凍干的試劑 A 和試劑 B 溶解后，轉(zhuǎn)移到一個(gè)5 mL 或10 mL 的離心管中，再各補(bǔ)加1.5 mL 支原體檢測(cè)溶液）。按每管50 μL可分別分裝到50個(gè)1.5 mL離心管中，根據(jù)待檢測(cè)的樣品數(shù)量及陰性對(duì)照數(shù)量確定A、B試劑的用量（不用的試劑放置于-80 ℃冰箱低溫保存，隨用隨?。Ｔ噭〢和試劑B，放室溫5 min左右（注：不能加熱），等其熔解后放冰上待用。
【注】：試劑 A 和試劑 B 只能在每次檢測(cè)之前從-80 ℃冰箱取出的，熔解后在室溫放置的時(shí)間盡可能的短，不能超過(guò)20 min。熔解后，放冰上的時(shí)間也不能超2 h。已經(jīng)融化后的試劑 A 和試劑 B 不能再次凍存使用。
2.陰性對(duì)照的設(shè)置
　　本試劑盒每次檢測(cè)都必須設(shè)置陰性對(duì)照。陰性對(duì)照除了沒(méi)有培養(yǎng)細(xì)胞外其他成分*相同，包括其中的血清批次、含量、抗生素等含量也必須*相同。陰性對(duì)照配制完后放于4℃冰箱。如果有些樣品實(shí)在沒(méi)有合適的陰性對(duì)照或者不知道樣品原來(lái)的培養(yǎng)基組成，可以嘗試使用含10%血清的 DMEM 培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。
3.陽(yáng)性對(duì)照的設(shè)置
　　可用已經(jīng)檢測(cè)含有支原體污染的樣品作為陽(yáng)性對(duì)照。
4.待測(cè)樣品的準(zhǔn)備
　　為了準(zhǔn)確判斷細(xì)胞是否有支原體的污染，具體操作如下（請(qǐng)嚴(yán)格按照相應(yīng)的體積進(jìn)行操作）：
（1）貼壁細(xì)胞待測(cè)的細(xì)胞培養(yǎng)3 d且匯合度在70-90%左右時(shí)，取180μL-1500μL培養(yǎng)液上清，在普通臺(tái)式離心機(jī)上150 g (大約1000 rpm )低速離心 5 min，準(zhǔn)確吸取離心后的上清到一個(gè)新的1.5 mL離心管內(nèi)，丟棄含細(xì)胞沉淀的原有離心管。懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞需要在換液傳代后，至少讓細(xì)胞生長(zhǎng)3 d再取培養(yǎng)液進(jìn)行上述操作。
【注1】：離心力要嚴(yán)格控制在150 g左右，該離心力下，哺乳動(dòng)物細(xì)胞將被沉淀下來(lái)而支原體不會(huì)。更高的離心力將可能導(dǎo)致支原體也被離心下來(lái)，從而導(dǎo)致假陰性。而更低的離心力將可能導(dǎo)致哺乳動(dòng)物細(xì)胞不能被離心沉淀下來(lái)，從而導(dǎo)致支原體經(jīng)測(cè)時(shí)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的ATP也被釋放到溶液中，從而導(dǎo)致假陽(yáng)性。
【注2】：待測(cè)細(xì)胞上清樣品越多，越有利于支原體污染濃縮富集，1500μL培養(yǎng)液上清，經(jīng)后續(xù)處理后，支原體濃度提高10倍左右。
【注3】：制備好的待測(cè)樣品如果不是當(dāng)天立即檢測(cè)，放于-80℃冰箱保存，不得放于室溫、4 ℃或-20 ℃冰箱，樣品在-80℃可以保存1 年；為了日后檢測(cè)方便，應(yīng)該同時(shí)凍存一些作為陰性對(duì)照的培養(yǎng)液。
（2）將含有上清的1.5 mL離心管，在臺(tái)式離心機(jī)上16000 g（大約13000 rpm）高速離心5 min，棄去上清。
【注】：切勿讓吸頭碰到離心管底部，底部為可能含有支原體的沉淀。往離心管內(nèi)，加入120 μ*期配好的陰性對(duì)照培養(yǎng)液。
（3）將上述經(jīng)過(guò)離心清洗一次的樣品，再次在普通臺(tái)式離心機(jī)上16000 g（大約 13000 rpm）高速離心 5 min，同樣小心吸走離心后的上清并丟棄。
【注】：同樣勿讓吸頭碰到離心管內(nèi)壁的底部外側(cè)。留下大約5 μL培養(yǎng)液的目的也是為了防止吸頭碰到離心管底部外側(cè)而將可能含有支原體的沉淀吸走；注意離心管放置方向與上一次離心時(shí)相同。
（4）向上述經(jīng)過(guò)兩次離心清洗的樣品中加入115 μL陰性對(duì)照的培養(yǎng)液，用移液槍上下吹吸10-20 次，將可能含有支原體的沉淀吹打均勻，用于后續(xù)支原體檢測(cè)（夠兩次檢測(cè)使用）。此時(shí)，總體積仍然約為120 μL）。
【注】：將培養(yǎng)液替換成陰性對(duì)照的培養(yǎng)液是為了排除一些細(xì)胞代謝產(chǎn)物對(duì)后續(xù)檢測(cè)的可能干擾。
5.支原體樣品檢測(cè)
（1）將溶解后的試劑 A、試劑 B放冰上融化（注意：不能加熱），試劑A和試劑B融化后立即用于檢測(cè)。試劑A、試劑B融化1 h后，檢測(cè)靈敏度開始顯著降低，試劑 A和試劑 B融化后不能反復(fù)凍融使用。
（2）吸取50 μL陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和待測(cè)樣品，分別移入不透明（白色或者黑色均可）的96孔板內(nèi)，加入50 μL冰上放置的試劑 A，室溫反應(yīng) 15 min。
【注】：不能使用透明的 96 孔板，否則孔與孔之間的發(fā)光值會(huì)互相干擾。
（3）吸取50 μL冰上放置的試劑B，加入到已反應(yīng)15 min的上述反應(yīng)液中，立即在多功能酶標(biāo)儀或者發(fā)光檢測(cè)儀（Luminometer）上，以儀器默認(rèn)的螢火蟲熒光素酶（Luciferase）的發(fā)光檢測(cè)參數(shù)的參數(shù)進(jìn)行發(fā)光值的檢測(cè)，5 min內(nèi)，連續(xù)測(cè)5次陰性對(duì)照和待測(cè)樣品的發(fā)光值，計(jì)算各自的平均值。
【注1】：發(fā)光檢測(cè)（Luminescence）與熒光檢測(cè)（Fluorescence）、吸收光檢測(cè)（Absorbtance）是不同的功能。吸收光檢測(cè)即常用的 OD 值檢測(cè)。熒光檢測(cè)（比如常見的 FITC 檢測(cè)）需要激發(fā)光，而發(fā)光檢測(cè)（如熒光素酶的活性檢測(cè)）不需要激發(fā)光。多功能酶標(biāo)儀常見的檢測(cè)功能有：吸收光檢測(cè)、熒光檢測(cè)和發(fā)光檢測(cè)，三種功能為獨(dú)立的功能。您如果不清楚您實(shí)驗(yàn)室的酶標(biāo)儀是否具有發(fā)光檢測(cè)功能，請(qǐng)咨詢您的實(shí)驗(yàn)室主任或者酶標(biāo)儀廠家。
【注2】：發(fā)光檢測(cè)時(shí)，應(yīng)該選擇不加載任何濾光片（不同酶標(biāo)儀表達(dá)方式不一樣，可能是：Unfiltered LUM、All wavelengths 或 Open hole）進(jìn)行檢測(cè)（此時(shí)讀值較高）或者使用螢火蟲熒光素酶（Luciferase）峰值的發(fā)光波長(zhǎng)560 nm進(jìn)行檢測(cè)（此時(shí)讀值較低）。
【注3】：可以通過(guò)調(diào)節(jié)酶標(biāo)儀的檢測(cè)靈敏度（Sensitivity）或延長(zhǎng)發(fā)光檢測(cè)的時(shí)間（Integration time，Measurement time），盡量讓陰性對(duì)照的發(fā)光值大于 1000。
【注4】：如果樣品是無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)上清，相應(yīng)的陰性對(duì)照培養(yǎng)基因不含血清，其發(fā)光值可能會(huì)比較低， 甚至只有 100 左右的發(fā)光值，此時(shí)可以在陰性對(duì)照培養(yǎng)基中加入10%的胎牛血清或小牛血清，當(dāng)然無(wú)血清細(xì)胞上清樣品也必須用含10%的胎牛血清或小牛血清的陰性對(duì)照培養(yǎng)基進(jìn)行替換（高速離心后替換，見上述步驟4）后，再進(jìn)行檢測(cè)。加入血清后一般可以明顯提高陰性對(duì)照的發(fā)光值。
6.結(jié)果判斷
　　計(jì)算待測(cè)樣品的發(fā)光平均值與陰性對(duì)照的發(fā)光平均值的比值：
（1）如果比值>1.2，說(shuō)明待測(cè)樣品有支原體污染（陽(yáng)性）。嚴(yán)重的污染該比值可以達(dá)到10以上。
（2）如果比值在1.1-1.2之間，說(shuō)明待測(cè)樣品可疑有支原體污染（可疑陽(yáng)性）。該樣品需要繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)后，重新檢測(cè)。如果繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)后，重新檢測(cè)的比值仍然在1.1-1.2之間，應(yīng)該判為陰性。
（3）如果比值<1.1，說(shuō)明待測(cè)樣品無(wú)支原體污染（陰性）。

表1：本試劑盒產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)

產(chǎn)品圖片

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